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Taq SYBR® Green qPCR Premix (Universal)

AS050038
货号 货期 规格 / 价格 询价

Taq SYBR® Green qPCR Premix (Universal)

品牌

Annoron-安诺伦

货号

AS050038

产品分类

PCR系列

研究领域

Taq SYBR®  Green qPCR Premix

(Universal)

REF: AS050038

 

 

 

储运条件

长期保存请于 -20℃避光保存,Mix 融解后可在 4℃避光条件下稳定存放 一个月,尽量避免反复冻融。

 

产品组成

 

组分

规格

Taq SYBR®  Green qPCR Premix (Universal)

 1 ml

 

产品简介

Taq SYBR®  Green qPCR Premix  SYBR®   Green I 嵌合染料法 专用 qPCR 试剂,为 2× 预混液,包含除引物和 DNA 样品以外的所  qPCR 组分,可减少操作步骤,缩短加样时间,降低污染几率。其 核心组分是经抗体修饰的热启动 Taq DNA 聚合酶,配合精心优化的 Buffer 体系以及 PCR 反应促进因子, 使产品具有特异性强、扩增效 率高等特点,有效抑制非特异性扩增,可对宽广浓度范围的模板进行 准确定量,  获得稳定可靠的 qPCR 结果。

预混液中含有独特校正染料,与一系列 qPCR 设备兼容,包括需要 ROX 校正的仪器,实验操作过程中不需要额外添加染料来校正仪器。

 

使用方法

1. 使用注意

①  Mix 中预混有染料, 其保存或反应体系配制过程应避免强光照射; ② 使用前上下颠倒轻轻混匀 Mix, 请勿涡旋振荡混匀, 避免产生过多 气泡 ;

③ Mix 中含有 Universal  校正染料, 适用于所有机型, 无需额外添加 染料。

 

2. 建议的 qPCR 反应体系

 

试剂

使用量

终浓度

Taq SYBR®  Green qPCR Premix

10 μl

正向引物 (10 μM)a

0.4 μl

0.2 μM

反向引物 (10 μM)a

0.4 μl

0.2 μM

DNA 模板 b

X μl

10~200 ng/20 μl

Nuclease-Free Water

To 20 μl

 

a. 通常推荐的引物终浓度为 0.2 μM,反应效果不佳时可在 0.1~1 μM 范围内进 行调整;

b. 推荐模板加样量为 1~2 μl,如模板类型为未稀释 cDNA 原液,模板添加量不 应超过总反应体系的 10%。不同种类 DNA 模板中含有的靶基因拷贝数目不同, 必要时可进行梯度稀释,以确定最佳的 DNA 模板添加量。

 

 

 

 

3. qPCR 反应程序(可根据机型适当调整)

两步法

 

步骤

温度

时间

预变性

95

30 sec

变性

95

10 sec

退火 & 延伸 a

60

30 sec

熔解曲线 b

使用仪器默认采集程序

 

三步法

 

步骤

温度

时间

预变性

95

30 sec

变性

95

10 sec

退火 a

55~65

10 sec

延伸 a

72

30 sec

熔解曲线 b

使用仪器默认采集程序



a. 根据引物的 Tm 值进行退火 & 延伸(退火) 温度的设定;若扩增片段在 200  bp 以内, 退火 & 延伸(延伸)时间可以设置为 15 sec;此外, 退火 & 延伸(延伸) 时间的设置还需根据您使用的 qPCR 仪所需要的最短数据采集时间自行调整;

b. 不同 qPCR 仪的熔解曲线采集程序有差别, 一般可使用仪器默认的熔解曲线 采集程序。

 

4. 实验优化

若使用默认反应条件反应性能不佳时,则需要进行反应条件的优 化,可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行:

 引物浓度调整

当引物终浓度在 0.1~1.0 μM 范围之间变化时,引物浓度越低, 扩增特异性越高,但扩增效率会有所下降。

 扩增程序优化

需提高扩增特异性,可使用两步法程序或提高退火温度;需提高 扩增效率,可使用三步法程序或延长延伸时间。

5. 引物设计原则

 扩增产物长度建议控制在 80~200 bp

 引物长度为 18~25 bp

 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1℃为佳,Tm 值控制在 58~62℃为佳;

 引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之间;

 引物 AGCT 整体分布尽量要均匀,避开 T/C 或者 A/G 的连 续结构(特别是 3' );

 引物 3' 端最后一个碱基最好为 G 或者 C

 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列;

 使用 NCBI BLAST 功能检索确认引物的特异性。

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