RNA干扰整体实验服务—RNAi基因干扰

RNA干扰（RNAi基因干扰、SiRNA实验）：RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程，小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解，阻断相应基因表达。艾柏森生物提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段（SiRNA）和构建载体RNA（SnRNA）两种形式。实验委托者只需提供干预基因名称或基因序列ID，艾柏森生物免费设计合适的干预位点，保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达，抑制效率不低于70%。

RNA干扰（SiRNA实验）流程
第一步 确定干扰基因，设计并合成合适的小干扰RNA（片段型或载体型小干扰RNA）。
第二步  预转染实验，进行细胞培养，摸索转染条件、时间并进行必要的检测（WB、PCR等），确定干预效果最佳的一对小RNA。
第三步  正式实验，设置合理实验分组，进行瞬时或稳定转染。
第四步  转染后检测，根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。

RNA干扰（SiRNA实验）检测（可根据委托者实验需求选择做）
1. 细胞检测：细胞增殖毒性MTT、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移、细胞侵袭；
2. 蛋白检测：免疫印迹WB、免疫细胞化学ICC、免疫荧光IF、流式细胞术FCM、酶联免疫ELSIA；
3. 分子生物检测：RT-PCR、实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR(MSP)；
4. 其他检测：生化检测、酶类检测、脂类检测、糖类检测。

实验案例： YYYY细胞在XXXX基因干扰后的增殖及侵袭能力实验
第一部分：实验细胞筛选
一、免疫荧光实验
实验试剂：PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4)，非免疫山羊血清，Triton X-100，BSA抗体稀释液，XXXX蛋白一抗 (1:100)，二抗AlexaFluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫荧光（IF）染色：倒出细胞培养液，PBS冲洗三次；2-4%甲醛固定15分钟；1×PBS缓冲液（0.01 M，pH7.4）洗涤3次，每次5分钟；滴加非免疫山羊血清（内含0.3%Triton X-100）封闭液,覆盖液面2-3mm,室温放置60min，甩去多余液体；滴加一抗plscr1 50μL（1:100），4℃过夜；PBS洗3次，每次5分钟；滴加荧光标记的上述二抗50μL（1：200），室温 60分钟；PBS洗3次各5min；荧光显微镜下观察、拍照，每指标照相2套图像。
IF染色结果（400倍）: 通过荧光染色可以分析出，XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最突出。

YYYY细胞

BBBB细胞

    

CCCC细胞

二、RT-PCR实验
实验材料：细胞样品4份，分组编号（见图片标示）
试剂：TrizolReagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026；ReverTraAce-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO#FSK-100；PCR Master Mix（2x） Fermentas # K0172；DNA Marker DL2，000， TaKaRa D501A；0.1%DEPC水、氯仿（分析纯）、异丙醇（分析纯）75%乙醇；AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO，K499；10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523；0.5mg/ml EB 溶液，实验室常备；1×TBE, 实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器：PCR仪,ABI9600；电泳仪，北京六一仪器公司，DYCP-31DN型；高速离心机，湘仪H1650-W； 紫外分光光度计，上海江仪仪器有限公司，UV-7502C(751)；成像系统，柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料：
Homo- XXXX-F    5-cacccatgtctaccaaagtt -3，Homo-XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3，片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F  5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，Homo-GAPDH-R  5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，片段长度   450bp
实验步骤：
1、RNA提取：每样本加入1mlTrizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎，细胞约106—107)；匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿，震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min；将水样层转移至干净的试管，加入0.5倍体积的异丙醇，混匀后-20℃下静置10-15min，在2~8℃下12,000×g离心10min；移去上层悬液，将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤，在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min，弃去上清液；适度干燥RNA沉淀后，加入适量0.1% DEPC水，使RNA完全溶解；2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量：紫外分光光度计开机预热30 min；用蒸馏水洗涤石英比色皿，吸水纸吸干，加入DEPC水后，放入样品室的S池架上，关上盖板；设定紫外光波长（260nm、280nm）后校零（每次检测前均需调零）；将待测样品适当稀释（RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl）后，记录编号和稀释度；把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板；分别测定260nm和280nm波长时的OD值（吸光度在0.1—0.5范围为最佳）；用蒸馏水洗涤石英比色皿，酒精浸泡。
3、实验结果判断：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：OD260/OD280≈2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

计算A260/ A280比值，比值≥1.8，满足实验要求。        
RT-PCR实验步骤：略
产物用琼脂糖凝胶电泳检测：扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl（DNA样本8μl+上样缓冲液2μl） ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟，清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值：阳性条带以Gelpro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD值。

点样说明及IOD参考值分析：

R值为目的基因PLSCR1参考IOD值/内参基因GAPDH参考IOD值
XXXX基因在YYYY细胞中表达量最突出。

三、WB实验
实验试剂：XXXX蛋白多抗(1:400)，37Ka；GAPDH单抗（1:1000）,37Ka；RabbitAnti Goat IgG/HRP（1:30,000）；GoatAnti mouse IgG/HRP(1:50,000)
WB操作流程：略
实验结果：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。

XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量最高。
通过上述实验，确定有YYYY细胞来进行XXXX基因沉默实验最具意义。